CELL期刊——设计抗体作为治疗药物

抗体药作为一类数量庞大且仍在迅速壮大的药物，已经让众多的患者获益。《Cell》近期发表的一篇综述性文章 “Designing antibodies as therapeutics”，对抗体设计的新兴方向做了重点阐述，包括增强抗体的抗肿瘤疗效，组织器官的定向递送，以及抗体药物所面临的可开发性挑战（免疫原性风险评估、皮下给药）。我们对这篇文章进行了较为专业和系统的介绍，希望能给读者带来获益。

目前，已有超过100种抗体药物获批用于治疗人类的多种恶性疾病。自2014年以来，美国食品药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)每年会批准6-13种抗体药物。绝大多数获批抗体药物还是传统的IgG结构，但也出现了新的结构，如ADC、双抗和抗体片段等 (图1A)。获批抗体药主要用于治疗肿瘤、自身免疫病和慢性炎症 (图1B)，同时也逐步扩展到传染病、血液疾病、神经系统疾病、眼科疾病、代谢疾病、肌肉骨骼疾病和器官移植等多种疾病。从靶点热度上看，有13个靶点，其上市抗体药物数量已超过了3种(图1B)。大多数抗体药物的给药方式为静脉注射(i.v.)或皮下注射(s.c.)(图1B)。抗体药物发挥治疗效应的作用机制（MOA）主要包括：配体阻断、受体阻断、受体下调、靶细胞耗竭、受体激动(信号诱导)以及可溶性靶抗原的清除或分解代谢等。

图1：抗体药物概览

1、增强抗体药物的抗肿瘤疗效

1.1 IgG

IgG是目前抗肿瘤抗体的主要形式，为了增强其细胞毒性效应器功能及抗体依赖性细胞毒性（ADCC）， 对不少于6 个 Fc 的位点进行了突变或聚糖修饰。抗肿瘤抗体的常见靶点包括 B 细胞谱系标记物，如 CD19 和 CD20、生长因子受体（表皮生长因子受体EGFR和人表皮生长因子受体2 HER2）等（图1B）。

1.2抗体偶联药物（ADC）

除lgG外，ADC是第二类最常见的抗肿瘤抗体药物形式，已有11个ADC获批(图1B)， 至少80个ADC在临床开发中。ADC是一种复杂的分子，它将抗体的靶向能力与通过可切割或不可切割连接物连接的细胞毒性载荷相结合。

ADC药物的设计，除了要考虑靶点和机体内生物环境外，还需要考虑的原则有：第一，特异性要求，最小化抗原表达的阈值，通过高亲和力的工程抗体实现靶点的内化，及其与双特异性和双表位的结合；第二，最近一款基于拓扑异构酶I抑制剂的ADC药物在治疗实体瘤中获得成功，这款ADC中药物与抗体比例（DAR）适中，这让我们重新考虑对超强细胞毒载荷的追求；第三，除了在肿瘤中优先释放载荷外，还应设计合适的连接子（Linker）来改善疏水性载荷的溶解度和相关ADC的药代动力学；第四，偶联位点可以影响药效和暴露程度；第五，利用蛋白酶激活抗原结合的抗体前药可能会减轻脱靶效应产生的毒性。

1.3双特异性、三特异性及多特异性抗体

迄今为止，双特异性抗体药物主要用于肿瘤治疗，临床开发中的双抗药物数量已飙升至200余种，其中大多数药物在 I 期临床试验中。双抗的发现具有很强的经验性，其结构形式、表位、亲和力和价态决定了药物制备和检测的复杂性。双抗结构也对药物的生产带来了极大的挑战，包括细胞株构建，双抗纯化和分析表征。

双抗在肿瘤之外也获得了越来越多的临床应用。例如，emicizumab（抗IXa/X因子）获批用于治疗血友病A，faricimab（抗VEGF/Ang-2）在眼科被批准用于治疗新生血管性年龄相关黄斑变性。在神经系统疾病方面，双特异性药物（抗靶点/转铁蛋白受体）被用于促进大脑摄取。在感染性疾病中，双特异性药物用于保护机体免于受到病原体（如铜绿假单胞菌）的侵害。在自免性疾病中，双特异性药物的应用包括对促炎性细胞因子的双阻断。例如，romilkimab（抗IL-4/IL-13）最近完成了治疗弥漫性系统性硬化的II期临床研究。

1.4可激活抗体

一些抗肿瘤抗体（包括免疫检查点抑制剂），会存在严重的安全问题，如脱靶毒性。抗体的安全性风险可能因以下因素而加剧：正常组织上的靶抗原表达、高效药物形式（如ADC和TCE）的使用以及抗体对肿瘤的低效定位。设计具有很低或没有抗原结合活性的可激活抗体，以及在肿瘤微环境（TME）或肿瘤相关引流淋巴结（DLN）中选择性激活的抗体，可以降低与正常组织表达靶点相关的安全性风险（图2）。

抗体可被多种激活物激活，包括表2中列出的三种常见激活物。设计抗体前药应用于不可逆的激活包括肿瘤相关蛋白酶的裂解。另外，条件性激活抗体用于可逆激活，如温和的酸性pH值或高ATP浓度(表1)。

1.5 IgM 和 IgG 六聚体

因为IgM比IgG更复杂，迄今为止，在临床试验阶段的IgM抗体药物仅20余种。具体而言，IgG、IgM五聚体和IgM六聚体分别具有4、21和24条多肽链，并且通常分别具有 2、51 和 60 个 N-糖基化位点。

IgM的高价性会使细胞表面受体得到更广泛的交联——这是激动型抗体潜在的理想特性。例如，五聚化抗DR5 IgM抗体 (IgM-8444)在体外比对应的抗DR5 IgG抗体诱导癌细胞凋亡能力更强，IgM-8444目前正在进行治疗实体瘤的I期临床试验。将抗SARS-CoV-2刺突蛋白的IgG (IgG-14)转换为IgM五聚体(IgM-14)形式，其体外中和SARS-CoV-2的能力提高了230倍。IgM-14正在健康志愿者中利用鼻内和口腔内喷雾的给药形式进行I期临床试验。另外，作为IgM药物的替代方法，Fc点突变也可赋予lgG1在与细胞表面抗原结合时高效六聚化的能力—HexaBody技术。

图2：获批及临床阶段的抗肿瘤抗体药物

表1：可激活抗体

2 器官和组织定向递送抗体药物

2.1将抗体有效递送至大脑

由于血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的存在，系统给药下的抗体或蛋白质分子向大脑递送的效率极低。这导致大脑中蛋白药物的浓度远低于血浆中的浓度。多个不同实验方法检测的结果显示只有约0.01%至0.35%的蛋白药物能够进入大脑。

科学家们已经开发了多种方法来增强抗体的BBB穿透性。其中，受体介导的穿胞作用（receptor-mediated transcytosis, RMT）已被广泛用于增加抗体在中枢神经系统的暴露量。转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子和低密度脂蛋白的受体常被用来将靶向药物递送入大脑中。尽管这些方法能够将抗体及其他蛋白质药物在大脑中的浓度提升10到20倍，但大脑中药物的绝对水平仍然很低（不到血浆中药物的2%）。JR-141（又名pabinafusp alfa）是一种转铁蛋白受体抗体与艾杜糖醛-2-硫酸酯酶的融合蛋白。它为利用受体介导的穿胞作用（RMT）促进大脑对蛋白质药物的吸收提供了强有力证据。更多突破血脑屏障的方法正在不断的被探索和挖掘中，例如，嗜神经病毒、纳米颗粒、聚焦超声以及鞘内注射(IT)和脑实质递送等。这些方法都存在其特有的优势，但也有相应的局限性。

2.2抗体口服给药

抗体口服给药的潜在优势在于：①提高患者的生活质量，②极大提高患者的治疗顺应性，③降低治疗成本。

为了实现抗体的口服给药，需要克服诸多障碍：一是消化酶和微生物酶会降解抗体药物，二是广泛的pH值范围（pH 1.5~8.0）下导致的抗体变性。此外，肠道内的粘液及上皮细胞形成了抗体口服给药的主要物理屏障；而由于肠道运输时间短且多变，这又极大提升了透过此屏障的难度。抗体口服给药的挑战还包括需要复杂的制剂：一方面用来保持其物理和化学稳定性，另一方面用来促进其在特定作用部位的吸收或释放。多种不同的方法正在被组合使用以期缓解口服递送抗体和其他蛋白药物遇到的障碍，包括使用蛋白酶抑制剂、吸收增强剂和自动注射器，但用其进行长期治疗的安全性仍是一个悬而未决的问题。目前正在积极开发口服给药的抗体有抗CD3 抗体foralumab，该药物正处于治疗克罗恩病的临床Ib 期。

2.3吸入式抗体药

吸入式给药可使抗体在呼吸道的局部浓度达到较高水平，可以降低系统用药所带来的安全风险（表 2）。迄今为止，尚无吸入式给药的抗体药被批准上市，而被批准上市的吸入式给药的蛋白质药物也只有极少数。肺部递送蛋白质药物最常用的装置是雾化器，有时也会使用干粉吸入器。

吸入式递送抗体药物的主要障碍是其稳定性不足，包括雾化过程中剪切力引起的变性以及肺部蛋白酶对药物的降解等。同时，由于获批的可用于吸入递送的稳定赋形剂很少，抗体变性后会导致其免疫原性的增加；这些都让抗体药的吸入式给药变得更加困难。已有多个不同形式抗体片段的吸入式给药启动了临床试验研究，但由于其疗效不足，大多数都已终止。尚不清楚疗效不足是由于靶标或抗体选择不当、药代动力学差还是递送不足所导致。目前口服吸入的抗体药临床试验包括治疗哮喘的一种抗TSLP Fab药—CSJ117（临床II期）。

表2：器官和组织定向递送抗体药

3 抗体开发面临的两大挑战

文章重点讨论了两个重要的可开发性挑战，即免疫原性风险的评估及改善和皮下给药，这两方面的进展将会对未来抗体治疗带来深远的影响。

3.1抗体疗法的免疫原性风险评估和改善

为了提升抗体药物的临床应用潜力，会对抗体功能进行工程化改进，但改进的同时可能会增加其产生免疫原性的风险，如抗药物抗体(ADA)的产生等。ADA会直接降低抗体的疗效，或与抗体形成免疫复合物，导致药物被加速清除，降低了安全性，甚至会导致临床研究的终止。例如，人源化的PCSK9抗体bococizumab因~48%病人在给药一年后产生了ADA，使其疗效减弱，导致临床开发中止。相比之下，另外两款靶向PCSK9的全人源抗体alirocumab (5.5% ADA)和evolocumab (0.3% ADA)的ADA的发生率要低得多，最后均被批准用于高胆固醇血症的治疗。最近FDA和EMA等监管机构也对临床前蛋白药物免疫原性风险评估提出了相应要求。

目前，有多种实验方法用于评估免疫原性风险，通常需要结合起来使用。In silico方法主要通过预测肽段与MHC II的结合能力来预测T细胞表位；体外实验方法包括T细胞激活实验、MHC相关肽蛋白质组学(MAPPs)及树突状细胞摄取实验等；体内实验则是在动物(常用小鼠)身上模拟药物在人体内的反应。例如，emicizumab抗体设计时就首先通过In silico手段对其免疫原性风险进行了预测，并随后进行了T细胞表位的工程化去除，这也可能解释了该双特异性抗体临床阶段的低ADA发生率。

3.2皮下制剂抗体的开发

目前已有超过30种抗体药物获批用于皮下注射治疗非肿瘤性疾病（图1B）。皮下给药的优点是给药快，只需几分钟（而静脉注射则需数小时），患者也可在家中自行给药。但皮下注射也存在一定的挑战，如需控制较小的给药体积（通常0.5~2.0mL），这就意味着需要较高的抗体浓度（目前获批的抗体最高浓度可达到200mg/mL），但并非所有抗体都能达到。同时，高浓度也可能会导致高粘度、聚集、沉淀、凝胶化或溶液浑浊等现象的发生。

电荷稳定自相互作用纳米粒子光谱法，可检测抗体在低浓度下分子间相互情况，从而预测其是否适合高浓度制剂开发。添加配方辅料，如NaCl或精氨酸-盐酸，来减弱分子间的相互作用，也为减轻或规避高浓度抗体的高粘度提供了可选策略。透明质酸酶可部分水解透明质酸，从而使皮下给药体积最大可达15ml。目前，已有4种以上抗体与透明质酸酶的共制剂被批准用于肿瘤治疗，即曲妥珠单抗，曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗，利妥昔单抗和达雷木单抗。

4. 结语

抗体未来的临床机会是追求“高挂的果实”，比如难于获得的、之前理解不足的或认为“不可成药”的靶点等。例如，有效的抗体胞内递送将大大扩大“可成药”靶点的范围，但目前仍非常难以实现。虽然当下尚未实现，但是预计不久的将来机器学习将会给生物医学以及抗体药物的开发带来极大的变革。